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腺病毒包裝

腺病毒包裝

簡要描述:

腺病毒(Adenovirus)是目前Z高效可靠的重組病毒表達系統之一,可用于在哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白。

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       腺病毒(Adenovirus)是目前zui高效可靠的重組病毒表達系統之一,可用于在哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白。其具備以下優點:
  1. 宿主範圍廣。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞,除可感染幾乎所有人的細胞類型外,還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
  2. 因腺病毒的感染不依賴細胞周期,故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞。
  3. 腺病毒具有嗜上皮細胞特性,因大多數腫瘤細胞均屬于上皮細胞,這使得腺病毒非常适合應用于基因治療領域。
  4. 病毒滴度高,可用于動物水平的實驗。
  5. 有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細胞基因組中;實驗中雖然會有一定機率出現RCA(即複制型腺病毒),但由于大多數成人體内都有針對腺病毒的抗體,所以一般危害不大。

技術要點

重組腺病毒的包裝制備:重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位(pfu)中分離獲得的。一個單色斑是線性載體質粒轉染後在20×15 cm闆上由293A細胞連續侵染後被挑選和擴增形成的。重組腺病毒可通過超速離心純化,并測定滴度及進行PCR鑒定。純化後重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml,獲得的量為2-4 ml。
重組腺病毒的特性:一般的,單個腺病毒通常是在30×150mm細胞培養皿中制備的。
獲得量:1×10病毒顆粒/細胞
滴定濃度:1×1010~1×1012個病毒基因組/ml
zui終體積:1 ml純化後的病毒液(儲存于PBS)
儲存:批量儲存的zui佳條件為-80°C
幾種病毒載體的區别:

腺病毒表達系統
慢病毒表達系統
逆轉錄病毒
病毒基因組成
雙鍊DNA
單鍊RNA
單鍊RNA
載導容量
< 8 kb
< 8 kb
< 6kb
基因整合功能
無。病毒基因組遊離于宿主基因組外,瞬時表達外源基因
有。病毒基因組整合于宿主基因組,長時間、穩定表達外源基因
有。
表達豐度
高水平表達
表達時間
快(1-2天)
慢(2-4天)
快(1-2天)
感染細胞類型
分裂和不分裂細胞
分裂和不分裂細胞。适用于難轉染細胞
感染分裂細胞,但在幹細胞中表達效率低
滴度TU/ml
10^12
10^9
10^9
四環素誘導系統
不可以
TET-ON , TET-OFF
不可以
毒性作用
細胞毒性
遺傳毒性
遺傳毒性
免疫原性
高免疫原性
低免疫原性
低免疫原性
動物模型
不能得到轉基因動物
可産生轉基因動物,效率達50以上
可以,但很難
安全系數
能否用于MIRCORNA
可以
可以
不可以
RNAi
病毒進入細胞往往引起細胞内幹擾素反應,不适合做RNAi實驗
适合,是RNAi實驗的優選工具
可以用作RNAi實驗
基因過表達
包裝容量較大。可以滿足較大基因的包裝,是過表達基因的優選工具
包裝容量有限,過表達的基因過大時,病毒滴度受到影響
包裝容量有限,過表達的基因過大時,病毒滴度受到影響
常見應用
1、體外細胞基因轉導2、基因治療
1、體外細胞基因轉導2、基因治療
體外細胞基因轉導,突變篩選,功能基因庫構建 

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