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RNAi幹擾檢測

RNAi幹擾檢測

簡要描述:

RNAi幹擾檢測 是指在進化過程中高度保守的、由雙鍊RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。

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      RNAi幹擾檢測 是指在進化過程中高度保守的、由雙鍊RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。基因沉默,主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄後水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常轉錄;PTGS是啟動了細胞質内靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導緻TGS和PTGS。

  RNAi幹擾檢測 主體實驗:
  一、成功将siRNA表達載體導入目的細胞
  如果目的細胞的質粒轉染效率較低(低于70%),則應采用腺病毒或慢病毒載體,利用病毒載體的高感染率、高表達特性,更好地開展RNA幹擾主體實驗。
  二、設置好分組和對照
  按照nature的标準,一個嚴格的RNAi介導knockdown實驗要有6個對照:
  ⒈轉染試劑對照(監控轉染及培養條件對結果的影響);
  ⒉nonsense siRNA對照(監控外源核酸本身對結果的影響);
  ⒊positive siRNA對照(監控假陰性);
  ⒋技術重複對照(也叫off-target 對照,也就是利用至少2個靶點的siRNA同時實驗,2個siRNA互為off-target control,當兩者的表型相同時,才有可能是特異性的knockdown效應);
  ⒌rescue 對照(knockdown之後做超表達,看是否有性狀的逆轉,這也是為了說明knockdown的特異性);6.全表達組掃描對照(就是轉錄/表達芯片掃描,以zui終确定表型不是由于off-target造成)。
  實際實驗中,全表達組掃描對照很少有文獻涉及。其它幾個對照中,1,2兩種對照即所謂的空白細胞對照、NC對照,基本是所有雜志都要求具備的。4,5兩種對照,主要是為了解決off-target效應,選做一種即可,一般建議選5,涉及的實驗即所謂的“RNA幹擾回複實驗”,
  三、RNA幹擾效率的檢測(體外)
  一般應該從mRNA水平、蛋白質水平、細胞表型水平三個層次來檢測幹擾效率。
  mRNA水平:RT-PCR、Real-time PCR;蛋白質水平:Western-blot、ELISA、免疫組化;細胞表型水平:MTT、克隆形成實驗、流式細胞檢測、細胞小室實驗等。RNA幹擾效率在動物模型上的進一步驗證(體内) 動物模型實驗可以采取“體内法”和“體外法”。
  體内法,即先做裸鼠成瘤模型,再将質粒或病毒導入裸鼠,檢測RNA幹擾效果。此法操作複雜,對質粒和病毒産品的質和量要求都較高,但是比較貼近實際,說服力較顯著。體外法,即先将質粒或病毒導入腫瘤細胞,再将腫瘤細胞導入動物體内,然後檢測RNA幹擾效果。此法操作較簡單,對質粒和病毒産品的質量要求較低,所以為大多數文獻所采用。建議采用此方法來進行動物模型水平的實驗。

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