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熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR檢測

簡要描述:

熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到廣泛應用;實時熒光定量PCR:在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信号積累實時監測整個PCR進程,Z後通過标準曲線對未知模闆進行定量分析的方法。

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 熒光定量PCR技術與普通PCR的區别:
  理論上PCR是一個指數增長的過程,但是實際的PCR擴增曲線并不是标準的指數曲線,而是S形曲線。
  這是因為随着PCR循環的增多,擴增規模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模闆等各種PCR要素逐漸不敷需求,PCR的效率越來越低,産物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以後,PCR就進入了平台期。由于各種環境因素的複雜相互作用,不同的PCR反應體系進入平台期的時機和平台期的高低都有很大變化,難以精确控制。所以,即使是96次PCR重複實驗,各種條件基本一緻,所得結果有很大差異,所以在實驗過程中我們不能根據zui終PCR産物的量直接計算出起始DNA拷貝數。


  熒光定量PCR的方法:
  熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類,特異性檢測方法是在PCR反應中利用标記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測産物;而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中,加入過量熒光染料,熒光染料特異性地摻入DNA雙鍊後,發射出熒光信号。前者由于增加了探針的識别步驟,特異性更高,但後者則簡便易行。
  熒光定量PCRzui常用的方法是DNA結合染料SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法,在這裡主要介紹這2種方法,其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。
  1、非特異性SYBR Green I染料法
  SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料(結合示意圖),在遊離狀态下,SYBR Green I發出微弱的熒光,但一旦與雙鍊DNA結合後,熒光大大增強(作用機理圖)。因此,SYBR Green I的熒光信号強度與雙鍊DNA的數量相關,可以根據熒光信号檢測出PCR體系存在的雙鍊DNA數量。
  2、特異性Taqman水解探針法
  Taqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎,Taqman熒光探針為一寡核苷酸,兩端分别标記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時,發射基團發射的熒光信号被淬滅基團吸收;
  PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探針酶切降解,使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信号,即每擴增一條DNA鍊,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信号的累積與PCR産物形成完全同步。從而實現定量(如下圖)。常用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX。

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