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RNA抽提

RNA抽提

簡要描述:

RNA可分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取實質就是将細胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白、DNA等雜質,Z終獲得高純RNA産物的過程。 由于RNA樣品易受環境因素特别是RNA酶的影響而降解,提取高質量的RNA樣品在生命科研中具有相當的挑戰性。RNA提取對樣品的新鮮性要求非常高,獲取樣品後Z好立即提取RNA,若無條件立即實驗,應于-80℃或液氮中。

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 RNA抽提操作步驟:
  1. 勻漿處理:
  a.組織 将組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
  b.單層培養細胞 直接在培養闆中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養闆)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養闆面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導緻提取的RNA有DNA污染。
  c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反複吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
  2.将勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白複合物完全分離。
  3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
  5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
  6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
  7. 把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
  8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉澱,離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。
  9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。
  10.室溫放置幹燥或真空抽幹RNA沉澱,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心幹燥,過于幹燥會導緻RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

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