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成功完成Western Blot檢測,必須滿足4個條件
發布時間:2017-02-21   點擊次數:759次
   成功完成Western Blot檢測,必須滿足4個條件:
  凝膠洗脫:轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來,如果蛋白質還截留在凝膠中,将無法在膜上進行分析。
  吸附到膜上:在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将無法在膜上進行分析。
  處理期間仍截留在膜上:在轉移後的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印迹膜上。
  處理過程中可接近:被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸,如果蛋白質被掩蓋則無法檢測。
  成功進行Western Blot檢測,則設置合适正确的對照是必不可少的,隻要正确設置了這些對照,即可快速和準确的找到WB的問題所在,并保證實驗結果的準确性和特異性!一般需要設置的對照如下:
  陽性對照:明确表達檢測蛋白的組織或細胞,用于檢測抗體的工作效率
  陰性對照:明确不表達檢測蛋白組織或細胞,用于檢測抗體的特異性
  二抗對照:不加一抗,用于檢測二抗的特異性
  内參對照:檢測标本的質量和二抗系統
  空白對照:不加一抗和二抗;用于檢測膜的性質和封閉的效果
  Western Blot檢測基本過程
  1、獲取細胞或組織裂解物
  1)根據檢測蛋白的位置選擇合适的裂解buffer:
  )選擇合适的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準确性!
  2、蛋白定量
  常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量後,可根據情況将标本保存在-20°C /-80°C備用,進行免疫沉澱(IP)或者直接進行電泳分離蛋白
  3、電泳分離蛋白質
  根據待測蛋白狀态确定電泳條件
  根據待測蛋白分子量大小确定凝膠濃度
  4、轉膜
  根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合适的膜類型。常用的轉移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜(NC膜)和尼龍膜,其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。
  5、封閉
  去掉膜上多餘的非特異性結合位點,降低背景。常用的封閉溶液有:含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
  6、一抗孵育
  一抗的選擇成功與否,是整個WB實驗成功的關鍵:選擇一抗有以下幾個注意點:
  選擇适合檢測标本種屬的一抗(說明書有驗證)
  選擇适用于WB實驗方法的一抗(說明書有驗證)
  選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體
  一抗的保存和使用:
  根據說明書的要求條件進行抗體的保存;一般需要将抗體分裝後放入-20度保存,避免反複凍融。
  抗體的工作液zui好現配現用,在4度保存zui好不要超過2周
  根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異,說明書推薦的稀釋比例隻作參考,需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測,然後選擇信噪比zui好的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度,可進行多個稀釋比例進行摸索zui佳稀釋度(1:100-1:3000)。
  孵育條件:推薦4°C孵育過夜(一般大于18個小時),根據抗體親和力不同孵育時間有所區别
  内參的選擇和使用:WB過程監測以及目的蛋白定量的标準!
  7、二抗孵育
  根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度,可進行多個稀釋比例進行摸索zui佳稀釋度(1:1000-1:20000)。孵育條件一般為室溫1-2小時
  8、底物孵育
  選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光,靈敏度高且背景低,節省抗體用量
  9、結果分析和檢測
  凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片
  Note:從封閉開始,每步之間都需要用TBST進行洗滌,3次,每次5min
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