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ELISA檢測在不同類型樣本的不同處理辦法
發布時間:2016-12-23   點擊次數:735次
   ELISA檢測在不同類型樣本的不同處理辦法
  通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的,如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等,不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正确的處理樣本是保證ELISA檢測的正确性和準确性的*步,下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。
  1、  血清
  血清是zui常用于ELISA檢測的一類樣本,處理也比較簡單。
  用無熱原、無内毒素的試管或離心管采集血液标本,将試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜,使血清析出。(zui好将試管或離心管傾斜放置,使液面橫截面增大,能使血清更大程度的析出。)4℃ 1000×g離心20分鐘,仔細收集上清。建議将血清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反複凍融。
  采血過程中應避免溶血,因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質,在以HRP為标記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色,而導緻檢測的不準确性。同時也應避免細菌污染,因為菌體内可能含有内源性的HRP從而導緻檢測的假陽性。
  2、  血漿
  用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液标本,标本采集後30min内4℃ 1000×g離心15min,取上清即血漿。将上清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反複凍融。避免使用溶血或高血脂的标本。
  常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸橼酸鈉等,檢測時還應仔細閱讀試劑盒說明書,檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。
  3、  細胞培養上清
  取細胞培養上清到離心管,1000×g離心20min,除去細胞碎片及雜質,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反複凍融。
  4、  細胞裂解液
  1)  吸去培養闆内的培養基,用胰酶消化細胞,加适量培養基将細胞從培養闆上吹下來。懸浮細胞可省略。
  2)  收集細胞懸液,1000×g離心10min,棄去培養基,用預冷的PBS潤洗3次。
  3)  加入适量的預冷PBS或細胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。通常6孔闆一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。
  4)  将樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反複凍融幾次,使細胞充分裂解。也可将樣品進行超聲破碎,以達到裂解的目的。
  5)  4℃ 10000×g 離心10min,除去細胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反複凍融。
  5、組織勻漿液
  1)  将組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗,洗去組織表面殘留的血液或雜質。
  2)  将組織塊稱重,記錄後剪碎,碎塊應盡量小,便于勻漿得更充分
  3)  将組織按一定的比例加入預冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿,勻漿時置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量:PBS體積=1:9的比例勻漿,例如1g的組織樣本對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要适當調整,檢測後計算樣品濃度時應乘以相應的稀釋倍數)
  4)  吸取勻漿液到離心管,4℃ 5000×g 離心5~10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反複凍融。
  6、  尿液、唾液等其他液體生物樣本
  1000×g離心20min,取上清即可檢測。
  總的來說,因為ELISA隻能檢測可溶性蛋白的含量,所以應保證所有樣本均為澄清的液體,沉澱或懸浮物都應離心去除。
  為了保證檢測的準确性,保存于-20℃或-80℃的樣本zui好在1~6個月内檢測;4℃保存的樣本應在1周内進行檢測。
  另外,還應保證樣本不含NaN3,因為NaN3會抑制HRP的活性,從而導緻假陰性的結果。
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